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簡要描述：基因敲入（Knock-in, KI）小鼠通過在基因組特定位點(diǎn)精準(zhǔn)插入外源序列（如報告基因、人類疾病突變或條件性表達(dá)元件），是研究基因功能調(diào)控、人類疾病模擬和藥物測試的核心工具
更新時間：2025-06-26 17:14:44
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一、KI小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線選擇
方法 | 周期 | 插入片段限制 | 適用場景 |
CRISPR-HDR | 2-4個月 | <5 kb | 快速構(gòu)建短片段KI（如點(diǎn)突變、FLAG標(biāo)簽） |
ES細(xì)胞同源重組 | 6-12個月 | 無限制 | 大片段插入（如Cre重組酶、人源化基因） |
CRISPR-轉(zhuǎn)座子/病毒 | 3-5個月 | 10-50 kb | 超大片段插入（如BAC轉(zhuǎn)基因替代） |
二、KI小鼠模型構(gòu)建CRISPR-HDR方案（短片段插入推薦）
1. 靶點(diǎn)設(shè)計與供體制備
gRNA設(shè)計：
靶向插入位點(diǎn)（避開功能域），使用CHOPCHOP優(yōu)化效率。
供體DNA設(shè)計：
5'同源臂 60-100nt
目標(biāo)序列+篩選標(biāo)記*
3'同源臂 60-100nt
化學(xué)修飾：ssODN（單鏈）需3'硫代磷酸酯化，dsDNA（雙鏈）需磷酸化。
沉默突變：在gRNA靶區(qū)引入1-2 bp突變防止重切（必需?。?/p>
2. 受精卵注射
注射混合物：
Cas9蛋白 (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN/dsDNA (100 ng/μL)。
胚胎移植：
移植20-30個注射后胚胎至假孕母鼠。
3. 基因型鑒定
PCR策略：
外側(cè)引物（同源臂外） + 內(nèi)側(cè)引物（插入序列內(nèi)）→ 僅陽性鼠能擴(kuò)增。
測序驗證：確保插入序列無indel突變。
4. 品系建立
F0嵌合體：與野生型交配，篩選生殖系傳遞后代（通常50%概率）。
三、ES細(xì)胞同源重組方案（大片段KI）
1. 靶向載體構(gòu)建
5'同源臂 1.5-3kb
目標(biāo)序列
FRT-flanked NeoR
3'同源臂 1.5-3kb
DTA負(fù)選標(biāo)記
關(guān)鍵元件：
同源臂：長度與插入片段正相關(guān)（>5 kb插入需≥3 kb同源臂）。
篩選標(biāo)記：NeoR（后續(xù)可通過Flp刪除）。
2. ES細(xì)胞操作
電轉(zhuǎn)與篩選：
G418（NeoR）篩選10-14天，Pick 200-300個克隆。
陽性克隆驗證：
長片段PCR（覆蓋整個插入?yún)^(qū)域）。
Southern blot：確認(rèn)單拷貝整合。
3. 小鼠制備
囊胚注射：將陽性ES細(xì)胞注入C57BL/6N囊胚。
傳代：嵌合體與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。
四、條件性KI（cKI）附加設(shè)計
1. 雙loxP系統(tǒng)
策略：在目標(biāo)基因前插入loxP-stop-loxP（LSL）結(jié)構(gòu)，與Cre小鼠交配后激活表達(dá)。
應(yīng)用：
報告基因：Rosa26-LSL-tdTomato。
致癌基因：Kras-LSL-G12D。
2. 誘導(dǎo)型系統(tǒng)
Tet-On：rtTA + TRE-目標(biāo)基因，需多xi環(huán)素誘導(dǎo)。
五、經(jīng)典KI模型案例
插入類型 | 應(yīng)用 | 代表模型 |
點(diǎn)突變 | 模擬人類遺傳病（如APP突變） | APP-KI（阿爾茨海默?。?/p> |
報告基因 | 細(xì)胞譜系追蹤 | Rosa26-CAG-LSL-GFP |
人源化基因 | 藥物測試 | hCYP3A4-KI（代謝研究） |
六、關(guān)鍵優(yōu)化策略
提高HDR效率：
添加HDR增強(qiáng)劑（如Rad51 mRNA或RS-1）。
使用Cas9變體（如Cas9-D10A nickase）。
減少隨機(jī)整合：
線性化供體DNA（避免質(zhì)粒骨架整合）。
表型驗證：
mRNA水平：qPCR檢測插入基因表達(dá)。
蛋白水平：抗體檢測（如HA/FLAG標(biāo)簽）。
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