1. 冷凍保種實(shí)驗(yàn)服務(wù)內(nèi)容概述

A. 適用樣本類型

• 微生物：細(xì)菌（如大腸桿菌、乳酸菌）、酵母（如畢赤酵母）、絲狀真菌、噬菌體等。

• 細(xì)胞系：哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HEK293、HeLa）、干細(xì)胞、原代細(xì)胞等。

• 特殊樣本：難培養(yǎng)微生物（如厭氧菌）、基因編輯菌株（如CRISPR改造菌）。

B. 服務(wù)項(xiàng)目

2. 冷凍保種實(shí)驗(yàn)服務(wù)技術(shù)流程

A. 標(biāo)準(zhǔn)凍存步驟（以大腸桿菌為例）

1. 前處理：

• 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600≈0.6-0.8）。

• 離心收集菌體，去除殘留培養(yǎng)基（避免冷凍損傷）。

2. 凍存液制備：

• 常用保護(hù)劑：15-30%甘油（細(xì)菌）或10% DMSO（哺乳細(xì)胞）+培養(yǎng)基。

• 特殊配方：如海藻糖（提高真菌存活率）。

3. 分裝與標(biāo)記：

• 分裝至凍存管（推薦1.5 mL螺口凍存管），標(biāo)注菌株名稱、日期、濃度。

4. 冷凍程序：

• 梯度降溫：4℃ 30 min → -20℃ 1 h → -80℃長(zhǎng)期保存（或直接液氮?dú)庀啵?/p>

• 程序冷凍儀：精確控制降溫速率（如1℃/min，適用于敏感細(xì)胞）。

5. 液氮保存：

• 轉(zhuǎn)移至液氮罐（氣相：-150℃至-196℃），避免液相中管爆裂。

B. 復(fù)蘇驗(yàn)證

1. 快速解凍（37℃水浴，<1 min）。

2. 涂板或液體培養(yǎng)，檢測(cè)：

• 存活率（CFU計(jì)數(shù) vs 凍前）。

• 遺傳穩(wěn)定性（PCR驗(yàn)證目標(biāo)基因、質(zhì)粒保留率）。

• 污染檢測(cè)（無(wú)抗生素平板培養(yǎng)、16S rRNA測(cè)序）。

3. 關(guān)鍵注意事項(xiàng)

A. 提高存活率的策略

• 保護(hù)劑優(yōu)化：

• 細(xì)菌：甘油濃度需匹配菌種（如乳酸菌需20%甘油+5%脫脂奶粉）。

• 細(xì)胞：血清替代物（如HyClone FBS）減少批次差異。

• 冷凍速率：

• 快速冷凍（直接-80℃）適合多數(shù)細(xì)菌，慢速冷凍（程序降溫）適合真核細(xì)胞。

B. 避免常見(jiàn)問(wèn)題

4. 用戶常見(jiàn)問(wèn)題（FAQ）

Q1：凍存菌種能保存多久？

• -80℃：細(xì)菌通常2-5年，酵母1-3年（定期復(fù)蘇驗(yàn)證）。

• 液氮：>10年（需避免溫度波動(dòng)）。

Q2：如何運(yùn)輸凍存菌種？

• 干冰運(yùn)輸：維持-78℃，適合短期（<3天）。

• 液氮罐：長(zhǎng)期運(yùn)輸需專業(yè)容器（如Taylor-Wharton液氮罐）。

Q3：凍存后基因會(huì)突變嗎？

• 風(fēng)險(xiǎn)較低，但建議：

• 保存早期傳代菌株（避免累積突變）。

• 關(guān)鍵菌株備份多管（避免反復(fù)凍融）。

6. 延伸服務(wù)

• 菌種鑒定：16S rRNA測(cè)序、MALDI-TOF質(zhì)譜分析。

• 專l保藏：協(xié)助提交至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）或ATCC。